Page 221 - Movet - Laboratoriokäsikirja 2015

Tietoa qPCR:stä Mikä tarkoittaa PCR tutkimus?
Kvantitatiivinen PCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction) on menetelmä, jolla voidaan tunnistaa ja mitata spesifisesti ha- lutun DNA/RNA:n määrä näytteestä. Menetelmä perustuu kohde- alueen tunnistamiseen ja monistamiseen
Millainen näytemateriaali?
Näytteet voivat olla veri-, kudos-, uloste- tai poskisolunäytteitä. Analysoitava kohde-DNA/RNA voi olla peräisin viruksesta, bak- teerista, sienistä tai itse eläimestä.
Mitkä ovat qPCR tutkimuksen edut?
• menetelmällä pystytään spesifisesti tunnistamaan halutun patogeenin läsnäolo näytteestä ja lisäksi tarvittaessa helposti määrittämään patogeenin määrä.
• testissä tunnistetaan patogeenin DNA/RNA alue ja näin ollen spesifisyys on todella korkea. PCR-testeissä ei ole samanlaista ongelmaa ristireagoinnin kanssa kuin serologisissa testeissä.
• PCR:llä pystytään tunnistamaan varhaiset ja mahdollisesti jopa latentit infektiot, sillä menetelmä ei ole riippuvainen vasta-aineiden muodostumiselle, toisin kuin yleensä serologiset testit.
• PCR:llä pystytään tunnistamaan näytteestä erittäin herkästi pienikin määrä patogeenia, sillä testin kulussa kyseisen patogeenin tunnistettavaa geeniä monistetaan moninkertaisesti.
PCR-menetelmän vaiheet
1. DNA: eristys
DNA:n eristys on PCR-diagnostiikassa kriittinen vaihe. DNA:n tulee olla tarpeeksi puhdasta qPCR-analyysin tekoon. DNA ei saa sisältää PCR:ä inhiboivia eli haittaavia tekijöitä. Olemme tarkkaan selvittäneet ja tutkineet eri DNA-eristysmenetelmiä eri lähtömateriaaleista. Olem- me vertailleet niitä toisiinsa ja valinneet kullekin lähtömateriaalille par- haan menetelmän. Eristysmenetelmän valintaan vaikuttaa myös se, halutaanko tunnistaa viruksen genomia, bakteerin genomia tai mah- dollisesti sienen genomia. Luotettavan lopputuloksen varmistamisek- si on eristystä tehtäessä kaikille näille valittava omat olosuhteensa.
2. PCR analyysi, alukkeet ja ajo-olosuteet
PCR-analyysin aikana eristetystä lähtömateriaalista monistetaan spesifisesti haluttua geeni-aluetta alukkeita apuna käyttäen.
Kohdealukkeet on suunniteltu niin, että ne tunnistavat halutun lajin uniikkeja alueita ja näin ollen tunnistus on äärimmäisen spe- sifinen tapahtuma. Riippuen tutkimuksesta on mahdollista suun- nitella alukkeet, jotka tunnistavat tiettyjä esim. sienityyppejä tai alukkeet pystytään suunnittelemaan niin, että ne tunnistavat vain spesifisesti yhden halutun organismin. Tunnistus tapahtuu kohde- sekvenssin monistumista seuraamalla. Kaikkien analyysien ajo- olosuhteet ovat tarkkaan testattuja, jotta testin tarkkuus ja sitä kautta luotettavuus on saatu hiottua huippuunsa.
Kontrollit
Kontrolloimme DNA:n eristyksen onnistumista sisäisellä kont- rollilla, joka tunnistetaan myös PCR-ajossa. Näin voimme olla varmoja, että eristys on onnistunut. Tämän lisäksi analysoimme negatiivi-, positiivi-, sekä myös inhibitiokontrollin, jokaisessa tun- nistusajossa. Inhibitiokontrollilla varmistamme, ettemme saa vää- riä negatiivisia tuloksia, siksi että eristystapahtumassa olisi synty- nyt PCR-reaktiota estäviä tuotteita.
Movet Laboratoriokäsikirja | 221