Page 159 - BUKU AJAR ASAM NUKLEAT

Untuk mengkloning potongan besar DNA menjadi vektor kosmid, keduanya harus memiliki ujung lengket yang kompatibel. Vektor kosmid pertama-tama dilinierkan sehingga setiap ujungnya memiliki sisi cos. Kemudian kosmid linier dipotong dengan BamHI, yang menghasilkan ujung lengket dengan urutan GATC yang menggantung. DNA genom dari sumber yang diinginkan juga dipotong. Setelah dipotong BamHI, DNA ini dipotong secara parsial dengan MboI, yang juga menghasilkan ujung lengket GATC. Pemotongan parsial membuat beberapa sisi tidak dipotong dan memungkinkan segmen besar genom diisolasi. Segmen ini dicampur dengan dua bagian kosmid dan digabungkan menggunakan ligase. Konstruksi akhir dikemas ke dalam partikel lambda in vitro dan digunakan untuk menginfeksi E. coli.
4) Vektor Artificial Chromosomes
Kromosom Buatan; Selain tiga jenis vektor utama, yaitu plasmid, bakteriofaga, dan kosmid, kromosom buatan dapat dianggap sebagai jenis penting untuk vektor kloning. Kromosom buatan adalah alat umum dalam transfer gen karena mengandung sejumlah besar materi genetik. Kromosom buatan ragi atau YAC adalah salah satu kromosom buatan yang paling luas digunakan. YACs adalah ekstensi DNA yang mengandung semua elemen yang diperlukan untuk menyebarkan kromosom dalam ragi, yang merupakan asal replikasi, sentromer, dan telomer. Mereka juga memiliki sisi untuk enzim restriksi dan penanda genetik di mana mereka dapat dilacak dan dipilih. YAC dipotong oleh enzim restriksi yang sesuai, yang memungkinkan fragmen DNA asing untuk disisipkan di antara sentromer dan telomer. Dengan demikian, YAC mengandung fragmen DNA berukuran antara 100kb hingga 200kb, dan dapat ditempatkan di Saccharomyces cerevisiae, dan dapat direplikasi secara berdampingan dengan kromosom asli.
Kromosom buatan bakteri merupakan vektor kloning alternatif, pemanfaatannya meningkat secara proporsional. BAC adalah vektor kloning berdasarkan plasmid F E. coli, dan mengandung sisi yang cocok untuk enzim restriksi dan penanda yang dapat dipilih, seperti resistensi untuk kloroform. Plasmid yang telah dimodifikasi dipotong pada sisi restriksi, dan fragmen DNA
152