Page 157 - BUKU AJAR ASAM NUKLEAT

Vektor kloning lambda yang mengandung DNA kloning harus dikemas dalam kepala faga sebelum dapat menginfeksi E. coli. Sebelum DNA dapat dikemas, protein kepala faga harus diisolasi. Untuk melakukan ini, kultur E. coli, diinfeksi dengan lambda mutan yang tidak memiliki gen untuk salah satu protein kepala yang disebut E. Kultur E. coli yang berbeda diinfeksi dengan mutan lambda yang berbeda, yang tidak memiliki protein kepala faga D. Kedua kultur E. coli ditumbuhkan dengan lambda mutan dan virus diinduksi untuk memasuki siklus litik. Meskipun E. coli dilisis oleh faga, mereka tidak dapat membentuk kepala yang lengkap. Selanjutnya campuran larutan protein faga diisolasi. Setiap lisat mengandung ekor faga, protein perakitan, dan komponen kepala, kecuali D atau E. Kedua lisat ini dicampur bersama dengan vektor lambda yang mengandung DNA kloning. Meskipun pencampuran dilakukan secara in vitro, komponen tersebut dapat merakit sendiri menjadi faga fungsional yang dapat menginfeksi E. coli.
3) Vektor Cosmid
Vektor Kosmid; Kosmid adalah plasmid multikopi kecil yang membawa sisi cos yang berasal dari lambda faga dan dapat dikemas ke dalam kepala faga. Genom lambda berisi urutan pengenalan yang disebut sisi cos (atau ujung kohesif) di setiap ujungnya. Ketika genom akan dikemas di kepala, itu dibelah di satu sisi cos dan DNA linier dimasukkan ke dalam kepala sampai sisi cos kedua telah masuk. Jadi setiap DNA disisipkan di antara sisi cos yang dikemas. Kosmid biasanya mengandung beberapa sisi restriksi dan gen resistensi antibiotik.
Satu-satunya persyaratan DNA untuk pengemasan in vitro ke dalam faga adalah adanya dua sisi cos yang dipisahkan oleh urutan intervensi 37-51 kb. Kosmid dikembangkan berdasarkan pengamatan ini, dan hanyalah plasmid yang mengandung sisi cos faga. Sebagai plasmid, kosmid mengandung asal replikasi dan penanda yang dapat dipilih. Kosmid juga memiliki sisi pengenalan enzim restriksi yang unik di mana fragmen DNA dapat diikat. Setelah reaksi pengemasan terjadi, partikel yang baru terbentuk digunakan untuk menginfeksi sel E. coli. DNA disuntikkan ke dalam bakteri seperti DNA normal dan bersirkulasi melalui komplemen ujung cos. DNA sirkular akan dipertahankan dalam sel E. coli sebagai plasmid. Partikel faga dapat menerima antara 37 dan 51 kb DNA, dan sebagian
150