Page 178 - BUKU AJAR ASAM NUKLEAT

Meskipun inaktivasi penyisipan gen resistensi antibiotik memberikan cara yang efektif untuk identifikasi rekombinan, metode ini dibuat tidak nyaman dengan kebutuhan untuk melakukan dua skrining, satu dengan antibiotik yang memilih untuk transforman, diikuti oleh yang kedua, setelah pelapisan replika, dengan antibiotik yang membedakan rekombinan. Oleh karena itu, kebanyakan vektor plasmid modern menggunakan sistem yang berbeda. Contohnya adalah pUC8, yang membawa gen resistensi ampisilin dan gen yang disebut lacZ′, yang mengkode bagian dari enzim b-galaktosidase. Kloning dengan pUC8 melibatkan inaktivasi penyisipan gen lacZ′, dengan rekombinan diidentifikasi karena ketidakmampuan mereka untuk mensintesis 𝛽𝛽 -galaktosidase. Enzim 𝛽𝛽 - Galaktosidase adalah salah satu dari serangkaian enzim yang terlibat dalam pemecahan laktosa menjadi glukosa dan galaktosa, biasanya dikodekan oleh gen lacZ, yang berada pada kromosom E. coli. Beberapa galur E. coli memiliki gen lacZ yang dimodifikasi, gen yang tidak memiliki segmen sebagai lacZ′ dan mengkode bagian a-peptida dari b-galaktosidase. Mutan ini dapat mensintesis enzim hanya ketika mereka memiliki plasmid, seperti pUC8, yang membawa segmen lacZ′ yang hilang dari gen. Eksperimen kloning dengan pUC8 melibatkan pemilihan transforman pada agar ampisilin diikuti dengan seleksi aktivitas 𝛽𝛽-galaktosidase untuk mengidentifikasi rekombinan. Sel yang memiliki plasmid pUC8 normal adalah ampR dan mampu mensintesis b-galaktosidase membentuk koloni yang berwarna biru, sedangkan sel rekombinan juga ampR tetapi tidak dapat membuat 𝛽𝛽- galaktosidase membentuk koloni berwarna putih.
Gambar 109 Vektor kloning pUC8
171