Page 177 - BUKU AJAR ASAM NUKLEAT

Gambar 108 Ekspresi fenotip.
(Inkubasi pada 37°C selama 1 jam sebelum plating out meningkatkan kelangsungan hidup transforman pada media selektif, karena bakteri memiliki waktu untuk memulai sintesis enzim resistensi antibiotik. Sumber: Brown, 2010)
Kebanyakan vektor kloning plasmid membawa setidaknya satu gen yang memberikan resistensi antibiotik pada sel inang, pemilihan transforman dengan pelapisan ke media agar yang mengandung antibiotik yang relevan. Akan tetapi, perlu diingat bahwa resistensi terhadap antibiotik tidak hanya disebabkan oleh adanya plasmid dalam sel yang diubah. Gen resistensi pada plasmid juga harus diekspresikan, sehingga enzim yang mendetoksifikasi antibiotik dapat disintesis. Ekspresi gen resistensi dimulai segera setelah transformasi, tetapi akan membutuhkan beberapa menit sebelum sel mengandung cukup enzim untuk dapat menahan efek toksik antibiotik. Untuk alasan ini bakteri yang diubah tidak boleh dilapiskan ke media selektif segera setelah perlakuan kejut panas, tetapi pertama- tama ditempatkan dalam volume kecil media cair, tanpa antibiotik, dan diinkubasi untuk waktu yang singkat. Replikasi dan ekspresi plasmid kemudian dapat dimulai, sehingga ketika sel dilapisi dan bertemu dengan antibiotik, mereka telah mensintesis enzim resistensi yang cukup untuk dapat bertahan hidup. Menumbuhkan ke media selektif memungkinkan transforman untuk dibedakan dari non-transforman. Masalah berikutnya adalah untuk menentukan koloni yang ditransformasikan yang terdiri dari sel-sel yang mengandung molekul DNA rekombinan, dan yang mengandung molekul vektor self-ligated. Sebagian besar vektor kloning, penyisipan fragmen DNA ke dalam plasmid menghancurkan integritas salah satu gen yang ada pada molekul. Oleh karena itu rekombinan dapat diidentifikasi karena karakteristik yang dikodekan oleh gen yang tidak aktif tidak lagi ditampilkan oleh sel inang.
170