Page 193 - BUKU AJAR ASAM NUKLEAT

enzimatik, ia dimasukkan ke dalam untai yang tumbuh oleh polimerase. Namun, setelah ddNTP digabungkan, polimerase tidak dapat menambahkan basa tambahan ke ujung untai. Yang penting, ddNTP dimasukkan ke dalam Untai DNA oleh polimerase menggunakan basa yang sama, aturan penggabungan yang menentukan penggabungan nukleotida alami, di mana A menentukan penggabungan T, dan G menentukan penggabungan C (dan sebaliknya). Setelah polimerase menggabungkan ddNTP, rantai ekstensi berhenti. Untuk menentukan urutan DNA, seseorang melakukan empat reaksi per cetakan, di mana setiap reaksi digunakan untuk menentukan posisi relatif basa spesifik di sepanjang untai DNA. Hal ini dicapai dengan menambahkan dideoksinukleotida yang berbeda ke dalam setiap reaksi yang mengandung DNA polimerase, primer DNA, dan dNTP. Rasio antara ddNTP dan dNTP sangat penting untuk menentukan berapa banyak nukleotida (rata-rata) polimerase dapat bergabung ke dalam molekul DNA sebelum memasukkan ddNTP, sehingga menghentikan pemanjangan rantai. Primer DNA, ddNTP, atau dNTP dapat diberi label radio aktif atau diberi tag untuk memungkinkan deteksi untai DNA yang baru disintesis.
Karena reaksi ini dilakukan pada populasi molekul, elektroforesis reaksi menghasilkan tangga produk ekstensi yang sesuai dengan posisi basa itu di sepanjang untai DNA. Produk dari bejana reaksi yang berbeda dielektroforesis di jalur yang bersebelahan pada gel sekuensing, dideteksi, dan dibaca untuk menentukan sekuens DNA (Gambar 118). Semakin kecil fragmen menunjukkan identitas basa yang paling dekat dengan ujung 5' dan, karena DNA polimerase hanya menggabungkan basa dalam arah 5' hingga 3', membaca identitas produk yang lebih besar secara berurutan memberikan urutan 5' hingga 3' dari DNA untai yang diperpanjang. Biasanya, sekitar 300-400 basa dapat ditentukan dalam satu reaksi (manual).
186