Page 192 - BUKU AJAR ASAM NUKLEAT

Pada gambar 117 G, A, R, Y dan C mewakili reaksi kimia spesifik yang mengidentifikasi relative posisi basa guanin (G), adenin (A), purin ('R'; G dan A), pirimidin ('Y'; C dan T) dan sitosin (C). Dalam contoh ini fragmen diberi label di ujung 5 '. Membaca dari bawah ke atas gel, pola pita sesuai dengan urutan 5'GGTACGCCTGA 3'.
Fragmen yang lebih kecil menunjukkan identitas basa yang paling dekat dengan ujung berlabel, dan produk yang lebih besar secara berturut-turut menunjukkan identitas basa yang lebih jauh. Tergantung pada apakah label terletak di ujung 5' atau 3' untai DNA, urutan dasar dibaca dari bawah ke atas autoradiogram sebagai 5' hingga 3' atau 3' hingga 5', masing-masing. Metode penentuan urutan Maxam-Gilbert tidak secara rutin digunakan oleh sebagian besar peneliti karena beberapa alasan. Pertama, data yang dihasilkan dalam reaksi sekuensing kimia biasanya lebih ambigu daripada data yang dihasilkan dalam reaksi sekuensing enzimatik. Salah satu alasannya adalah bahwa reaktivitas kimia basa dipengaruhi oleh pengotor reaksi. Karena itu, ketika seseorang membaca urutan dari jenis reaksi ini, intensitas relatif dari produk reaksi harus dianalisis untuk interpretasi yang tepat dari identitas dasar. Selain itu, prosedur ini menggunakan bahan kimia berbahaya dan radioaktivitas tingkat tinggi. Jika dibandingkan dengan sekuensing DNA enzimatik, sekuensing Maxam-Gilbert menghasilkan informasi urutan yang relatif lebih pendek dan prosedur yang diperlukan untuk menghasilkan informasi ini lebih padat karya.
B. Sekuensing DNA Sanger
Metode pengurutan Sanger saat ini merupakan metode yang paling umum digunakan untuk pengurutan DNA. Metode ini memanfaatkan beberapa fitur DNApolymerase: Kemampuannya untuk membuat salinan yang tepat dari sebuah molekul DNA; arah sintesis enzimatiknya (5' hingga 3'); persyaratannya untuk untai DNA ('primer') untuk memulai sintesis; dan persyaratannya untuk 3 'OH di ujung primer. Jika 3’ OH tidak tersedia, untai DNA tidak dapat diperpanjang oleh polimerase. Jika dideoksinukleotida (ddNTP – ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP,), analog dasar yang tidak memiliki 3 'OH, ditambahkan ke dalam reaksi sekuensing
185