Page 196 - BUKU AJAR ASAM NUKLEAT

Pada gambar 119 di atas (a) Data sekuens awal dikumpulkan pada sekuenser DNA otomatis (Perkin-Elmer ABI PRISM Model 377). Empat warna menunjukkan kerabat posisi basa dalam fragmen DNA. Setiap garis vertikal empat warna sesuai dengan reaksi urutan yang berbeda. Fragmen yang lebih kecil (lebih dekat katoda) mengidentifikasi basa yang lebih dekat ke primer (5' ujung urutan informasi). (b) Bagian dari perwakilan, urutan yang dianalisis ditentukan oleh sequencer otomatis.
Seperti yang dijelaskan untuk reaksi pengurutan tipe Sanger yang menggunakan (terutama) isotop untuk mendeteksi produk ekstensi, beberapa pengurutan otomatis menggunakan empat jalur untuk mengumpulkan data dari reaksi. Namun, beberapa mesin menggunakan secara berbeda tag fluorescent berwarna untuk menunjukkan identitas dasar (Gambar 119). Pendekatan ini memungkinkan satu jalur berisi data untuk templat DNA dan meningkatkan empat kali lipat jumlah data yang terkandung pada gel. Pendekatan jalur tunggal ini dimungkinkan oleh pengembangan tag fluoresen yang dapat dilekatkan pada primer DNA atau ke ddNTP. Empat warna kimia digunakan oleh lebih banyak peneliti, dibahas sebagai berikut.
Ketika kimia pewarna primer digunakan untuk mendeteksi produk sekuensing, tag fluoresen dilampirkan ke sekuensing primer. Dengan kimia ini, primer disintesis empat kali dan tag yang berbeda (sesuai dengan identitas basa yang berbeda) melekat pada primer selama setiap sintesis. Selanjutnya, merakit empat reaksi terpisah, masing-masing berisi template DNA, ddNTP spesifik dan primer berkode warna, dan reagen yang diperlukan untuk menghasilkan produk ekstensi. Primer mendefinisikan awal (5' ujung) dari produk ekstensi, dan ddNTP yang tergabung mendefinisikan identitas dasar di ujung 3' dari molekul. Setelah reaksi selesai, produk yang diberi kode warna dikumpulkan dan disiapkan untuk dimuat ke dalam satu jalur pada sequencer otomatis.
Ketika kimia pewarna terminator digunakan untuk mendeteksi produk pengurutan, identitas dasar ditentukan oleh tag fluorescent yang melekat pada ddNTP. Jenis reaksi kimia ini dilakukan dalam tabung tunggal yang berisi cetakan
189