Page 197 - BUKU AJAR ASAM NUKLEAT

DNA, primer, keempat ddNTP berlabel fluoresen, dan reagen yang diperlukan untuk menghasilkan produk ekstensi. Primer mendefinisikan awal (5' akhir) dari produk ekstensi dan ddNTP berkode warna yang tergabung mendefinisikan identitas dasar pada ujung 3’ molekul. Setelah reaksi selesai, produk ekstensi disiapkan untuk dimuat ke dalam satu jalur pada sequencer otomatis. Keuntungan dari kimia pewarna terminator adalah bahwa produk ekstensi adalah: divisualisasikan hanya jika mereka diakhiri dengan label pewarna ddNTP; produk yang dihentikan sebelum waktunya tidak terdeteksi. Dengan demikian, sinyal latar belakang yang berkurang biasanya dihasilkan dengan metode ini.
D. Sekuensing Genom
Sangat sering, seorang peneliti perlu menentukan urutan fragmen DNA yang lebih besar dari panjang baca sekuensing rata-rata 500-1000 basa. Tidak mengherankan, strategi untuk mencapai ini telah dikembangkan. Strategi ini dibagi menjadi dua kelas besar, acak atau terarah. Pilihan strategi dipengaruhi oleh ukuran fragmen yang akan diurutkan. Secara acak sekuensing DNA, fragmen DNA besar (biasanya satu lebih besar dari 20.000 pasangan basa) dipecah menjadi fragmen yang lebih kecil yang dimasukkan ke dalam vektor kloning. Diasumsikan bahwa jumlah informasi yang terkandung dalam klon yang lebih kecil ini setara dengan yang terkandung dalam fragmen DNA asli. Banyak klon yang lebih kecil dipilih secara acak, templat DNA disiapkan untuk reaksi sekuensing, dan primer berlabel fluoresensi yang akan berpasangan dengan DNA vector urutan yang berbatasan dengan sisipan digunakan untuk memulai reaksi pengurutan.
Selanjutnya, urutan fragmen DNA asli direkonstruksi oleh komputer perakitan urutan yang diperoleh dari fragmen DNA yang lebih kecil. Strategi ini digunakan secara luas untuk menentukan urutan fragmen yang mewakili seluruh genom manusia. Namun, pendekatan acak ini biasanya tidak cukup untuk menyelesaikan penentuan urutan, karena kesenjangan dalam urutan sering tetap setelah perakitan komputer. Strategi terarah (dijelaskan di bawah) biasanya digunakan untuk menyelesaikan proyek urutan. Strategi pengurutan terarah, atau primer berjalan, dapat digunakan untuk mengisi celah yang tersisa setelah fase acak
190