Page 205 - BUKU AJAR ASAM NUKLEAT

Fragmen restriksi yang mengandung urutan kontrol membentuk kompleks dengan protein pengatur, semua fragmen lainnya tetap sebagai DNA. Lokasi urutan kontrol kemudian ditentukan dengan menemukan posisi pada peta restriksi dari fragmen yang dihambat selama elektroforesis gel. Ketepatan urutan kontrol yang dapat ditempatkan tergantung pada seberapa rinci peta restriksi dan seberapa nyaman penempatan lokasi restriksi. Urutan kontrol tunggal mungkin berukuran kurang dari 10 bp, sehingga retardasi gel jarang dapat menunjukkan dengan tepat. Oleh karena itu, teknik yang lebih tepat diperlukan untuk menggambarkan posisi urutan kontrol dalam fragmen yang diidentifikasi oleh retardasi gel.
b) Footprinting dengan DNase I
Prosedur umumnya disebut footprinting memungkinkan wilayah kontrol untuk diposisikan dalam fragmen restriksi yang telah diidentifikasi oleh retardasi gel. Footprinting bekerja atas dasar bahwa interaksi dengan protein pengatur melindungi DNA di wilayah sekuens kontrol dari aksi degradatif endonuklease seperti deoksiribonuklease (DNase) I. Fenomena ini dapat digunakan untuk menemukan sisi pengikatan protein pada molekul DNA. Fragmen DNA yang diperlakukan pertama-tama diberi label pada salah satu ujungnya, dan kemudian dikomplekskan dengan protein pengatur. Kemudian DNase I ditambahkan, tetapi jumlah yang digunakan dibatasi sehingga tidak terjadi degradasi lengkap dari fragmen DNA. Sebaliknya, tujuannya adalah untuk memotong setiap molekul hanya pada satu ikatan fosfodiester. Jika fragmen DNA tidak memiliki protein yang melekat padanya, hasil dari perlakuan ini adalah keluarga fragmen berlabel, yang berbeda ukurannya hanya dengan satu nukleotida.
Setelah pelepasan protein terikat dan pemisahan pada gel poliakrilamida, kelompok fragmen berlabel muncul sebagai tangga pita. Namun, protein terikat melindungi ikatan fosfodiester tertentu tidak dipotong oleh DNase I, yang berarti bahwa dalam kasus ini kelompok fragmen tidak lengkap, karena fragmen yang dihasilkan dari pembelahan dalam urutan kontrol tidak ada. Ketidakhadiran mereka muncul sebagai “Footprinting”, terlihat jelas pada Gambar 128. Wilayah molekul
198