Page 210 - BUKU AJAR ASAM NUKLEAT

a) Gen reporter
Sebelum melakukan analisis penghapusan, harus ditemukan cara untuk menguji efek penghapusan pada ekspresi gen kloning. Efeknya mungkin hanya akan diamati ketika gen dikloning ke dalam spesies asalnya: tidak akan ada pengujian yang baik untuk regulasi gen cahaya tanaman jika gen tersebut dikloning dalam bakteri. Vektor kloning sekarang telah dikembangkan untuk sebagian besar organisme, jadi kloning gen yang dikembalikan ke inangnya seharusnya tidak menimbulkan masalah. Kesulitannya adalah bahwa dalam kebanyakan kasus, inang sudah memiliki salinan gen di dalam kromosomnya. Bagaimana perubahan pola ekspresi gen kloning dapat dibedakan dari pola ekspresi normal yang ditunjukkan oleh salinan kromosom gen? Jawabannya adalah dengan menggunakan gen reporter. Ini adalah gen uji yang menyatu dengan daerah hulu gen kloning, menggantikan gen ini. Ketika diklon ke organisme inang, pola ekspresi gen reporter harus persis meniru gen asli, karena gen reporter berada di bawah pengaruh urutan kontrol yang persis sama dengan gen asli. Gen reporter harus dipilih dengan hati-hati. Kriteria pertama adalah bahwa gen reporter harus mengkode fenotipe yang belum ditampilkan oleh organisme inang. Jenis fenotipe dari gen reporter harus relatif mudah dideteksi setelah dikloning ke dalam inang, dan idealnya mungkin untuk menguji fenotipe secara kuantitatif. Kriteria ini tidak terbukti sulit untuk dipenuhi dan berbagai gen reporter yang berbeda telah digunakan dalam studi regulasi gen.
Setelah gen reporter dipilih dan konstruksi yang diperlukan dibuat, melakukan analisis penghapusan cukup mudah. Penghapusan dapat dilakukan di wilayah hulu konstruksi dengan salah satu dari beberapa strategi, contoh sederhana ditunjukkan pada (Gambar 132 dibawah ini). Efek penghapusan kemudian dinilai dengan mengkloning konstruksi yang dihapus ke dalam organisme inang dan menentukan pola dan tingkat ekspresi gen reporter. Peningkatan ekspresi akan menyiratkan bahwa urutan penekan atau pembungkaman telah dihilangkan, penurunan akan menunjukkan penghapusan aktivator atau penambah, dan perubahan dalam spesifisitas jaringan akan menunjukkan urutan kontrol yang responsif terhadap jaringan.
203