Page 212 - BUKU AJAR ASAM NUKLEAT

G. Mengidentifikasi dan Studi Produk dari Gen kloning
Selama bertahun-tahun kloning gen menjadi semakin berguna dalam studi tidak hanya gen itu sendiri tetapi juga protein yang dikodekan oleh gen kloning. Penyelidikan terhadap struktur dan fungsi protein telah sangat diuntungkan dari pengembangan teknik yang memungkinkan terjadinya mutasi pada titik-titik tertentu dalam gen kloning, yang menghasilkan perubahan terarah pada struktur protein yang dikodekan. Sebelum mempertimbangkan prosedur ini, pertama-tama kita harus melihat masalah yang lebih biasa tentang bagaimana mengisolasi protein yang dikodekan oleh gen kloning. Dalam banyak kasus, analisis ini tidak diperlukan, karena protein telah dikarakterisasi jauh sebelum eksperimen kloning gen dilakukan dan sampel protein murni sudah tersedia. Di sisi lain, ada saat-saat ketika produk terjemahan dari gen kloning belum diidentifikasi. Sebuah metode untuk mengisolasi protein kemudian diperlukan.
1) HRT dan HART dapat mengidentifikasi produk translasi dari Kloning Gen
Dua teknik terkait, hybrid-release translation (HRT) dan hybrid-arrest translation (HART), digunakan untuk mengidentifikasi produk translasi yang dikodekan oleh gen kloning. Keduanya bergantung pada kemampuan mRNA murni untuk mengarahkan sintesis protein dalam translasi tanpa sel. Ini adalah ekstrak sel, biasanya dibuat dari biji gandum yang berkecambah atau dari sel retikulosit kelinci (keduanya sangat aktif dalam sintesis protein) dan mengandung ribosom, tRNA, dan semua molekul lain yang diperlukan untuk sintesis protein. Sampel mRNA ditambahkan ke translasi tanpa sel, dengan campuran 20 asam amino yang ditemukan dalam protein, salah satunya diberi label (sering digunakan 35S-metionin). Molekul mRNA diterjemahkan ke dalam campuran protein radioaktif (Gambar 133), yang dapat dipisahkan dengan elektroforesis gel dan divisualisasikan dengan autoradiografi. Setiap pita mewakili satu protein yang dikodekan oleh salah satu molekul mRNA yang ada dalam sampel.
205