Page 54 - BUKU REFERENSI KLONING GEN
P. 54
8. Sekuensing
Proses sekuensing dilakukan dengan alat sekuensing otomatik "Aplied Biosystems DNA 373A Sequencer'. Proses ini meliputi dua tahap yaitu tahap pertama adalah PCR dan tahap kedua adalah pemurnian hasil PCR. Persiapan DNA templat yang digunakan untuk proses PCR dilakukan dengan isolasi DNA plasmid rekombinan Komposisi yang diperlukan pada reaksi PCR adalah : Ke dalam tabung ependorf 0,5 mL dimasukkan 3 μL DNA sampel (300 ng) kemudian ditambahkan 1,2 μL primer (2,4 pmol), dan ditambahkan ddH20 hingga volume akhir 9 μL. Campuran reaksi ditambahkan 6 μL DNTP (Taq dyeDeoxy Terminator Sekuensing Kit dari ABIPRSM yang telah mengandung bufer dan enzim Taq pobmerase) sehingga volume total 15 μL. Setelah tahap PCR selesai selanjutnya dilakukan tahap ke dua yaitu pemurnian, dengan menggunakan kolom. Kemudian DNA dikeringkan pada kosentrator (Concentrator type 5301 Eppendorf). Sampel DNA
54
