Page 36 - CASA Bulletin of Anesthesiology 2022, Vol 9, No 1 (1)

CASA Bulletin of Anesthesiology

因及 CACNAIS 基因与恶性高热密切相关，且以 RYR1 基因异常为主。欧洲一些国家专门组成了"欧

洲恶性高热研究组"(EMHG)，对恶性高热进行了深入广泛的研究，迄今为止发布了与恶性高热密切
相关的基因突变位点 50 个，48 个位于 RYR1 基因，2 个位于 CACNAIS 基因。目前美国已有基于二

代测序的 MH 易感基因的检测方案，但价格昂贵。综合考虑，我们开发了基于上述 SNP 的多重 PCR
毛细电泳片段分析检测方法，可以高效、便捷地对恶性高热进行筛查，非常适合临床应用。

目的

建立针对恶性高热患者的多重 PCR 毛细电泳片段分析方法，对疑似恶性高热患者进行多重
PCR 毛细电泳片段分析，对结果进行突变位点分析，结果经 Sanger 测序验证，探讨对恶性高热的

检测效果，为恶性高热的诊治和易感者的防治提供非常重要的参考价值。

检测原理、方法和结果

检测原理

将与恶性高热相关的 50 个单核苷酸多态性（SNP）位点分成 5 组（A/B/C/D/E），采用 5 组

引物组合物（见表 1），分别加入 5 个孔的反应体系，对样本进行多重 PCR 扩增，结合新一代毛
细管片段分析技术，同步快速地定性检测与恶性高热易感基因相关的 50 个 SNP 位点。

实验方法

2.1 标本收集采样优先选择血样标本采集卡或唾液卡（免提直扩）。已提取的高浓度全血
DNA 不能直接加入反应体系中，推荐使用赛默飞公司的 Qubit 系列荧光计测定浓度，稀释到本

试剂的最适检测范围 0.5-10ng/μL 后，再加 1μLDNA 到反应体系中扩增。

2.2 引物设计

针对 RYR1、CACNA1S 两个基因中与恶性高热易感性有关的 SNP 位点，共设计了五个
panel 包含 50 个 SNP 位点，其中 RYR1 基因上 48 个，CACNA1S 基因上 2 个。为保证结果的
可靠性，设置了 pcDNA 和人基因组内参。pcDNA 内参用于对检测全过程进行质量控制，人基
因组 DNA 内参，用于对样本采集、核酸提取和检测全过程进行监控。从美国国家生物技术信息

中心 (NCBI) 下载每个 SNP 位点序列，使用 Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad, USA) 比对分
析，选取高度保守序列，使用 DNASTAR 软件（DNASTAR Inc. Madison, WI, USA) 和 Premier
6.0 软件 (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA) 设计引物，同时对引物进行评
价，确保序列各个碱基均匀分布，扩增产物片段大小 100～400bp 之间，每个产物之间至少有

3bp 的差异。引物不能形成二聚体, 上下游引物 Tm 值差在 2℃之内，避免产生非特异性扩增。

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