Page 38 - CASA Bulletin of Anesthesiology 2022, Vol 9, No 1 (1)

CASA Bulletin of Anesthesiology

2.4 毛细管电泳片段分析法

多重 PCR 完成后，将 1 μL PCR 产物、0.25μL DNA Size Standard 500 (Applied
Biosystems, California, USA)加入到 8.75μL 高去离子化(Hi-Di)甲酰胺中。然后采用美国
Applied Biosystems 3500Dx 基因分析系统 (Applied Biosystems, California, USA) ，对 PCR

产物进行毛细电泳，选择“Fragment”分离方法。信号位置表示扩增片段长度(bp)，信号强度同时
以峰高和峰面积的形式表示。当峰高为> 500 相对荧光单位 (rfu) 时，结果被认为是阳性的。在
整个检测过程中，采用 ddH2O 作为阴性对照。

2.5 方法的建立和优化

方法的建立和优化应遵循一系列具体的原则：(1)引物特异性验证，确保每个检测靶点特征峰

明显且不被干扰； (2) PCR 反应程序和反应体系优化，包括 PCR 每步的反应时间和温度，引物的
浓度和比例、PCR 缓冲液、酶、dNTP，镁离子浓度和核酸模板的用量等。(3) 用于扩增人基因组
DNA 和 pc DNA 的引物也包含在 Primer Mix 中，应对相应的引物浓度进行研究，确保临床标本
中人基因组内参峰明显。(4) 质量控制，以阴性对照为模板的峰形图中只出现 1 个 pc DNA 峰，

表明 PCR 过程运行正常。两种内控峰均出现在临床标本的峰型中，表明 DNA 完整性良好，多重
PCR 扩增和毛细管电泳成功。

2.6 Sanger 测序

对多重 PCR 毛细电泳方法检测到的 MH 阳性样本，可通过 Sanger 方法进行验证。具体方法
为，针对每一个 SNP 位点设计一对扩增引物，对样本进行 PCR 扩增，得到的 PCR 产物经琼脂糖
凝胶电泳检测并切割回收目的条带，使用 UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒（上海生工生物工

程）对目的条带进行胶回收。然后使用 BigDye Direct Sanger Sequencing Kit（Thermo
Fisher）进行 PCR 测序反应，使用醋酸钠/乙醇法对 PCR 产物进行纯化。纯化后的 PCR 产物经
变性后，上测序仪（Applied Biosystems 3500Dx）进行 Sanger 测序。测序结果通过 NCBI

BLAST 进行比对分析 (https:// blast.ncbi. nlm. nih.gov) 。

实验结果

采用上述实验方法对 18 例有疑似 MH 症状的临床样本进行多重 PCR 毛细电泳片段分析，测
到其中 11 例样本均含易感基因突变（测到的突变位点有 c.6617C>G/T、c.1654 C>T、
c.487C>T、c.7048 G>A、c.6488 G>A、c.7361 G>A、c.14512 C>G、c.7304 G>A、c.7522

C>T、c.7522 C>G,其中两例出现 c.7361 G>A，其它突变类型各出现一次），然后对上述 11 例
样本进行 Sanger 测序验证，结果完全一致。以 RYR1 c.487C＞T（位点为 CT 突变型）为例，将
该位点的测序引物和 PCR 产物进行 Sanger 测序，结果见图 1A、1 B。对突变型为
c.6617C>G/T 的患者进行家族标本的采集（见图 2），对采集到的 26 例家属样本采用 PCR 毛细

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