Page 170 - BUKU AJAR ASAM NUKLEAT

umum. Gradien densitas dihasilkan dengan cara mensentrifugasi larutan, protein mengapung di atas gradien dan pelet RNA di bagian bawah. Posisi pita DNA dapat dilihat dengan menyinari radiasi ultraviolet pada tabung, yang menyebabkan ikatan EtBr berfluoresensi. DNA plasmid murni diambil dengan menusuk sisi tabung dan mengambil sampel dengan jarum suntik. EtBr yang terikat pada DNA plasmid diekstraksi dengan n-butanol dan CsCl dihilangkan dengan dialisis. Plasmid yang dihasilkan hampir 100% murni dan siap digunakan sebagai vektor kloning. DNA plasmid hanya terbentuk sebagian kecil dari total DNA dalam sel bakteri. Oleh karena itu, hasil DNA dari kultur bakteri mungkin sangat rendah. Amplifikasi plasmid perlu dilakukan, tujuannya adalah untuk meningkatkan jumlah salinan plasmid.
3) Pembentukan DNA Rekombinan
Setelah sampel DNA murni disiapkan, langkah berikutnya dalam eksperimen kloning gen adalah konstruksi molekul DNA rekombinan. Untuk menghasilkan molekul rekombinan ini, vektor, serta DNA yang akan dikloning, harus dipotong pada titik-titik tertentu dan kemudian digabungkan bersama secara terkendali. Memotong dan menyambung adalah dua contoh teknik manipulasi DNA, berbagai variasinya telah dikembangkan selama beberapa tahun terakhir. Selain dipotong dan digabungkan, molekul DNA dapat diperpendek, atau diperpanjang, disalin menjadi RNA atau menjadi molekul DNA baru, dan dimodifikasi dengan penambahan atau penghilangan gugus kimia tertentu. Manipulasi ini, yang semuanya dapat dilakukan di dalam tabung reaksi, memberikan dasar tidak hanya untuk kloning gen, tetapi juga untuk studi biokimia DNA, struktur gen, dan kontrol ekspresi gen.
Hampir semua teknik manipulasi DNA menggunakan enzim yang dimurnikan. Di dalam sel, enzim-enzim ini berpartisipasi dalam proses penting seperti replikasi dan transkripsi DNA, pemecahan DNA asing atau yang tidak diinginkan (misalnya, DNA virus yang menyerang), perbaikan DNA yang bermutasi, dan rekombinasi antara molekul DNA yang berbeda. Manipulasi pemotongan dan penyambungan yang mendasari kloning gen dilakukan oleh enzim yang disebut restriksi endonuklease (untuk pemotongan) dan ligase (untuk penyambungan).
163