Page 172 - BUKU AJAR ASAM NUKLEAT

Gambar 105 Ligasi dengan enzim Ligase
Setelah memotong molekul DNA asing dengan enzim restriksi yang sesuai, demikian juga vector harus dipotong dengan enzim restriksi yang sama, kemudian di ligasi dengan enzim ligase. Ligase ini bergabung dengan fragmen DNA secara kovalen. Dua persyaratan harus dipenuhi agar enzim ligase dapat melakukan tugasnya. Pertama, molekul harus menjadi substrat yang benar, yaitu, mereka harus memiliki gugus 3'-hidroksil dan 5'-fosfat. Kedua, gugus-gugus pada molekul yang akan digabungkan harus diposisikan dengan benar terhadap satu sama lain. Jika DNA ligase menemukan dua fragmen DNA yang disatukan dari ujungnya, itu akan menyegelnya bersama-sama. Dalam eksperimen rekayasa genetika, fragmen DNA yang ujungnya lengket cenderung menyatu untuk waktu yang lama. Fragmen DNA ujung tumpul tidak memiliki cara untuk disatukan, mereka berada jauh dari satu sama lain. Akibatnya, penyegelan ujung tumpul sangat lambat dan membutuhkan konsentrasi enzim ligase yang tinggi, selain konsentrasi fragmen DNA yang tinggi untuk disegel. Semua sel hidup menghasilkan DNA ligase, tetapi enzim yang digunakan dalam rekayasa genetika biasanya dimurnikan dari bakteri E. coli yang telah terinfeksi faga T4.
165