Page 47 - BUKU REFERENSI KLONING GEN
P. 47
b. Ligasi
Proses ligasi adalah menyambungkan fragmen DNA yang dikatalisis oleh enzim ligase. Proses ini dilakukan dengan perbandingan molar DNA sisipan dengan DNA vektor adalah 1 : 3, ligasi yang dilakukan harus ada kontrol ligasi. Kontrol ligasi yang digunakan adalah sebagai berikut:
(1) Sejumlah 2 μL vektor pUC 19 (80 ng) tanpa didefosforilasi dimasukan kedalam tabung eppendorf, lalu ditambahkan 1 μL bufer 10 x T4 ligase (Tris-HCI 25 mM pH 7,6, DTT 1 mM, NaCl 100 mM), dan ditambahkan 0,5 μL T4 ligase (0,5 unit). Selanjutnya ditambahkan ddH2O hingga volume akhir 10 μL. Campuran diinkubasi pada suhu 16 °C selama 16 jam.
(2) Ligasi vektor yang didefosforilasi dilakukan sebagai berikut: Sebanyak 2 μL DNA pUC 19 (80 ng) ditambahkan 1 μL bufer T 4 ligase 10 x yang mengandung seperti di atas, kemuclian
47
