Page 310 - Bloedstollig en bloedingsneiging

298 Bloedstolling en bloedingsneiging
Nu in het laboratorium van vandaag alle chemicaliën langs commerciële weg worden aan- geschaft is het leerzaam een vroeg leerproces van Pannekoek aan te halen teneinde het belang van zuiverheid en precisie bij experimenteel werk nog eens te benadrukken. In een recent interview vertelde hij wat hij in Gif sur Yvette met name had geleerd22:
‘... hoe heel precies om te gaan met de componenten die je gebruikt. Het was daar not done om bij- voorbeeld een enzym zoals RNA-polymerase, het belangrijkste enzym waar ik mee werkte, om dat te kopen. Je diende dat zelf te maken en zelf te karakteriseren. Alleen op die manier wist je waar je mee werkte. Ik herinner me: het zuiveren van dat enzym was een continu proces. Dat wil zeggen, je moest eerst ’s morgens vroeg bacteriën kweken en daarna werkte je net zo lang tot je helemaal klaar was. Het was een dag, een nacht en een dag. Dat deed je met zijn drieën of zo. En zo moest het gebeuren. Na ie- dere zuiveringsstap werd het getest op activiteit, op zuiverheid. Deze manier van werken was specifiek voor dat laboratorium. De concurrentie werkte vaak met gekochte enzymen wat tegenwoordig iedereen doet natuurlijk, waarbij de kwaliteit van commerciёle enzymen aanzienlijk is verbeterd. ... Het voordeel van zelf doen was dat je garantie had op de kwaliteit waarmee je werkt. Het RNA-polymerase uit E. coli bestaat uit een aantal subunits. Maar één specifieke subunit, de zogenaamde sigma-subunit, die het enzym voorschrijft waar het moet beginnen, dient volop aanwezig te zijn. Wanneer die sigma-subunit er níet is, dan verliest het RNA-polymerase zijn specificiteit. Dus je moet geen genoegen nemen met een preparaat dat te weinig van die sigma-subunit heeft want dan kan het enzym rare dingen doen. Die ervaring heeft mij geleerd om op belangrijke zaken heel precies te zijn.’
Zijn positie bij Moleculaire Biologie van het CLB maakte dat Pannekoek een grondlegger werd van de toepassing van dat vak binnen de wereld van hemostase- en trombose-onderzoek in Nederland.23 Binnen het CLB kwam hij terecht in een gespreid bed. Jan van Mourik werk- te er al meer dan tien jaar aan factor VIII-VWF-complex, wat op zijn beurt de specialiteit van Bonno Bouma in Utrecht was. Men wist in het begin van de jaren 1980 nog niet of het VWF-eiwit een apart eiwit was of een splitsingsproduct van factor VIII en dus afkomstig van hetzelfde gen. Aan Pannekoek de opdracht om deze vraag op te lossen terwijl over de hele wereld daaraan werd gewerkt. Er was dus veel concurrentie. Uiteindelijk bleek dat het gaat over twee verschillende eiwitten, afkomstig van twee afzonderlijke genen.
Daarmee samenhangend was de opdracht van de CLB-leiding om een proces te ontwik- kelen waarmee factor VIII op een moleculair-biologische manier kon worden geproduceerd, leidend tot zogeheten recombinant factor VIII. Inmiddels was dus bekend dat factor VIII en VWF een complex vormen waarbij de laatste in feite het dragereiwit is. Binnen het CLB beschikte men, zoals gezegd, over monoklonale antistoffen tegen factor VIII en VWF. De afdeling Moleculaire Biologie van het CLB werkte aan een veelheid van onderwerpen waar- onder factor VIII, VWF, t-PA en ook nog PAI-1: plasminogen activator inhibitor1. Tijdens een presentatie op het Scripps Research Institute wees Ted Zimmerman de Nederlandse gast- spreker Pannekoek erop dat deze aan álle T&H-gerelateerde onderwerpen leek te werken. De wat laatdunkende ondertoon kwam over en Pannekoek realiseerde zich dat hij zijn aandacht te veel verdunde waardoor er te weinig kritische massa in zijn onderzoeksprogramma zat.
In het midden van de jaren tachtig konden Pannekoek c.s. publiceren dat zij complemen- tair cDNA hadden gekloneerd voor menselijk VWF onder gebruikmaking van antilichaam- probes voor koloniescreening en het in kaart brengen van het gen op chromosoom 12.24 De klonering van compleet (full-length) cDNA van von Willebrand-factor (VWF) was weten- schappelijk een mijlpaal temeer omdat dit op dat moment het grootste gekloneerde cDNA was (bijna 9000 baseparen). Bovendien bleek het VWF-eiwit een opvallende structuur te be- zitten, bestaande uit meerdere domeinen die ieder een aparte functie hebben in de vele functies