Page 30 - VETNESIA EDISI 34
P. 30

RISET DAN KASUS



                                                                                oleh promotor VV p11K. Agar virus
                                                                                rekombinan ini aman dan berfungsi
                                                                                optimal, maka eGFP pada
                                                                                rekombinan didelete melalui
                                                                                promotor eGFP dan p11K pada
                                                                                dua situs Loxp.

                                                                                Koinfeksi/transfeksi.
          Gambar 3. Metoda pemurnian plak dilakukan dengan sel dikultur pada 6 plate tissue culture, diinkubasi
          sampai sel memenuhi plate 90%, dicentrifuse, dikoleksi, dan diencerkan 5 kali secara serial (5xdilution).  Prosedur koinfeksi/transfeksi
                                                                                ditunjukkan pada Gambar 2 diatas.
          setelah 4 jam oleh mekanisme       berfungsi secara optimal. Sistem   Metoda kerjanya sebagai berikut:
          represi translasi. Kelebihan Gen   rekombinasinya dirancang khusus,   sel (sel OA3.T) dikultur dalam
          TK adalah karena memiliki fenotipe   menggunakan situs Cre/loxP untuk   medium 2 mL DMEM, 10% FBS
          TK­negatif berfungsi untuk         mendelesi gen reporter dari virus   pada pelat 6­sumur (plate tissue
          menyeleksi suatu rekombinan        DNA rekombinan. Sistem ini terdiri   culture), diinkubasi pada suhu
          tanpa memerlukan marker            dari Cre recombinase dan dua       37°C dengan 5% CO2 selama 1
          tambahan. Selain gen TK, gen       urutan Loxp                        hari. Sel monolayer terinfeksi 70­
          nonesensial lainnya juga dapat     (ATAACTTCGTATANNNTANNNTA           90% dari pCaPVs = parental
          digunakan untuk menghasilkan       TACGAAGTTAT). Urutan yang          Capripoxvirus (Multiplicity of
          rekombinan misalnya, protein yang   tidak diinginkan antara dua situs   Infection (MOI) = 1) setelah
          dikodekan gen GTPV 135             Loxp dapat didelesi secara akurat   didiamkan 1­2 jam supernatannya
          berfungsi sebagai penghambat       dibawah aksi Cre recombinase.      dibuang. Sel­sel yang terinfeksi
          NF­κB dan apoptosis.                                                  pCaPV ditransfeksi dengan
          Menggunakan gen 135 sebagai        Promotor dan terminator untuk      plasmid transfer rekombinan (3–4
          tempat penyisipan pada kontruksi   transkripsi mRNA.                  µg/sumur), kemudian dikultur
          vektor rekombinan gen 135 GPTV                                        pada suhu 37 °C dengan 5% CO2
          ekspresi gen H peste des petits       Plasmid transfer rekombinan     selama 3­4 hari agar terjadi
          ruminants virus (PPRV) dapat       umumnya berisi urutan promotor     rekombinasi homolog antara
          merespon untuk produksi antibodi   yang efisien, seperti promotor VV   pCaPV dan plasmid untuk
          terhadap PPRV.                     p7.5K. Promotor ini merupakan      menghasilkan rCaPV.
                                             promotor awal/akhir tetap,
          Purifikasi marker rCaPVs.          sehingga protein asing dapat       Pemurnian plak rCaPV.
                                             diekspresikan dan diatur baik pada
             Rekombinan virus                awal maupun akhir infeksi virus.       Kultur sel tersebut di atas
          mengandung konsentrasi rendah      Promotor lain yaitu promotor p11K   diadsorpsi setelah didiamkan 1­2
          hanya  10 ^(­4)­ 10 ^(­3),         dapat digunakan untuk menyeleksi   jam. Inokulum diambil dan sel
          karena telah dimurnikan dari stok   ekspresi sebagian dari siklus     monolayer dilapisi dengan media
          virus aslinya. Rekombinan virus    hidup. Yang harus                  seleksi yang mengandung 1%
          tersebut, digabung ke dalam        dipertimbangkan saat merancang     agarosa. Plak fluoresen diambil
          plasmid transfer yang dimediasi    urutan gen asing untuk ditansfer ke   dari pengenceran plate culture
          satu atau lebih marker genetik.    dalam Gen awal VV adalah           tertinggi  ke dalam 0,5 ml media
          Marker genetik ini mencakup gen    terhadap akhir transkripsi yang    pertumbuhan pada 7­10 hari pasca
          yang dapat: (i) dideteksi dengan   hanya memiliki 50 bp dengan        inkubasi, kultur dibersihkan
          pewarnaan (misalnya,               urutan "TTTTTNT”. Urutan sinyal    sebanyak 3 kali supernatannya
          ­galaktosidase dan ­glucuronidase)   terminasi (TTTTTNT) digunakan    dibuang dan kemudian dilakukan
          atau fluoresensi (protein fluoresen   pada awal infeksi secara cepat dan   pengenceran serial 5­8 kali. rCaPV
          hijau yang disempurnakan, eGFP),   tepat.                             dianalisis dengan PCR dan
          (ii) dipilih oleh obat tertentu                                       dikonfirmasi dengan sekuensing
          (mikofenolat acid), (iii) diperlukan   Protokol produksi rCaPVs.      Sanger.
          untuk penyebaran virus (gen virus;   Konstruksi plasmid transfer
          A27L atau F13L) dan (iv)           rekombinan.                        Delesi eGFP dari rCaPV.
          diperlukan untuk replikasi virus
          pada garis sel tertentu (gen inang).  Plasmid dengan promotor VV          Langkah­langkah delesi marker
                                             p7.5K dirancang dan ditanam pada   gen dari genom rCaPV oleh sistem
          Delesi marker rCaPVs.              wilayah pengkodean TK. Ujung       Cre/loxP. Pertama, sel yang
                                             promotor adalah antigen asing      mengekspresikan Cre
             Dalam kontruksi vektor          dengan urutan sinyal terminasi     recombinase dimasukkan ke
          rekombinan virus seperti rCaPV     (TTTTTNT). Urutan enhanced         dalam labu T­25, diinkubasi sampai
          harus mendelesi marker             green fluorescent protein (eGFP)   tumbuh merata (konfluen) 70%,
          genetiknya agar aman dan           adalah marker genetik yang diatur   dan diinfeksi melalui rCaPV murni
                                                                                (MOI = 1) selama 1­2 jam.


                                       Oktober 2021        30
   25   26   27   28   29   30   31   32   33   34   35