Page 14 - BUKU AJAR HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

Buku Ajar High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu
standar, oleh karena itu maka perbandingan dilakukan dengan
menggunakan teknik kurva kalibrasi.

Saat ini, HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan yang
diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa
tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain:
farmasi; lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industri-industri
makanan. Kegunaan umum HPLC adalah untuk pemisahan
sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa
biologis; analisis ketidakmurnian (impurities); analisis senyawa-
senyawa mudah menguap (volatile); penentuan molekul-molekul
netral, ionik, maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa;
pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama;
pemisahan senyawa-senyawa dengan jumlah sekelumit (trace
elements), dalam jumlah yang banyak, dan dalam skala proses
industri, HPLC merupakan metode yang tidak destruktif dan
dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif.

Berdasarkan kekuatan/kepolaran fase gerak, HPLC terdiri dari:

 Fase Normal (normal phase), yaitu fase gerak kurang polar
dibanding fase diam.

 Fase Terbalik (reverse phase), yaitu fase gerak lebih polar
dibanding fase diam.

Cara kerja HPLC adalah sampel yang larut dalam fase gerak
diinjeksikan ke dalam kolom kromatografi dengan menggunakan
syringe. Volume yang ditampung adalah 0,2 ml, juk berlebih
akan dikeluarkan. Fase gerak akan dialirkan dengan
menggunakan pompa. Sampel yang masuk dalam kolom akan
didorong oleh fase gerak sehingga zat-zat yang terkandung
dalam sampel akan dianalisis dan bereaksi dengan fase diam.
Oleh detektor akan dibaca dan dihasilkan keluaran berupa grafik
dan data tinggi beserta luas puncak dalam bentuk angka.

1. Prinsip Pemisahan HPLC

Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan berdasarkan distribusi
komponen yang terdapat di fase diam dan fase geraknya.
Dalam kromatografi, senyawa satu dan lain dapat dipisahkan
oleh eluen. Di antara dua senyawa yang keluar dari kolom

8