Page 22 - Тахианаас хүнсний хордлого үүсгэгч CAMPYLOBACTER SPP.-ийг илрүүлсэн судалгааны дүн

[ШИНЖЛЭХ УХААНЫ МАГИСТРЫН ЗЭРЭГ ГОРИЛСОН БҮТЭЭЛ] Арга зүй [ШИНЖЛЭХ УХААНЫ МАГИСТРЫН ЗЭРЭГ ГОРИЛСОН БҮТЭЭЛ] Арга зүй

ДНХ – ийн нуклеотидын дарааллыг тогтоох шинжилгээ (DNA sequencing Gyr A). таслан авч 1%-ийн агароз гельд гүйлгэн ДНХ олширсон эсэхийг шалгав. ПГУ-ын
Дээрхи полимеразын гинжин урвал тавьж олшруулсан бүтээгдэхүүнээ цааш бүтээгдэхүүнийг агарозын гелээс таслан авч DNA isolation kit – р (Thermo Fisher
Puregene цомог (Centra systems, Inc., Minneapolis) ашиглан ДНХ цэвэршүүлэн ялгаж Scientific) цэвэршүүлэв. Цэвэршүүлсэн бүтээгдэхүүнийг мөн ижил праймер (хүснэгт7)
авав. Цэвэршүүлсэн ДНХ дээрээ доорхи хос праймеруудыг (хүснэгт 6 ) ашиглан ашиглан флюресцент өвөрмөц будагч бодисд холбогдох dideohenucleotides (ddNTPs)

Campylobacter spp.-ийн зүйлийн Gyr A (285bp) генийг олшруулав. Prism 3130xl (Applied агуулсан BigDye Terminator v1.1 and v3.1 cycle Sequencing Kits оношлуураар урьтал
biosystems, USA) автомат анализатораар өмнөх ПГУ-ын нөхцөлийн дагуу нуклеотидын денутараци 95 хэмд 10минут, 94 хэмд 30 секунд, 50 хэмд 30 секунд, 72 хэмд 1минут,
дарааллыг тогтоох шинжилгээ хийж гүйцэтгэнэ. Нуклеотидын дарааллыг тогтоосны эцсийн уртасгалт 72 хэмд 3 минутад дахин олшруулав. Үүссэн ПГУ- ын бүтээгдэхүүн
дараа NCBI вэб сайтын Blast align программыг ашиглан мутаци үүссэн эсэхийг дээр HiFI Formamid бүхий будагч бодис нэмж хөтлөгч болон дагагч праймераар салган
тодорхойлов. дээжийг 96 үүрт хавтанд хийж 7 бүхий полимер 4 хялгасан сорогч суваг болох
капиллярын (50см урттай) дагуу Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer бүхий
Gyr A генийг олшруулахад ашигласан праймерууд нуклеотидуудын байршлыг тогтоогч машинаар уншуулав.
Хүснэгт 7
Сонго дог Праймерийн олиго дараалал 5’-3’
ген Хөтлөгч –Forward Дагагч- Reverse Филогенетикийн шинжилгээ
Gyr A gyr A-5’- GAGTGTTATTATAGGTCGTGC-3’ gyr A- 5’-GGCACTATCACCATCTATAG-3’ Өгөгдлийн сан доторх клонт чанарын түвшинг асоциацын индексыг (IA)
тодорхойлох замаар тооцож гаргаснаас гадна J. Maynard Smith боловсруулсан
программаар /33/ бүх ДТ-үүд, удам тус бүрийн ДТ-үүдийн төлөөллийн дэд бүрдэлд
Multi locus sequence typing– ийн генийн дараалал тогтоох шинжилгээ (MLST) зориулан бодож олсон юм. Тухайн комплекс дэх ДТ-үүдийн доторх хамаарлыг MILD
DISTANCE MATRIX (K.A.Jolley) программаар аллелийн буруу хослолуудын зайн
ОЛДТТ-ийн судалгаанд зориулж дараах 7 локусыг сонгон авав. Үүнд: aspA
матрицыг байгуулах аргаар судлав. Локусын ялгаа бүрт ялгаатай аллелүүд хоорондоо
(аспартаза А), glnA (глютамин синтетаза), gltA (цитрат синтаза), glyA (серин
хамааралгүй гэж тооцон адил төстэй аргаар боловсруулалт хийв. Дараа нь зайн
гидроксиметилтрансфераза), pgm (фосфоглюкомутаза), tkt (транскетолаза), uncA
матрицуудыг SPLITSTREE-ийн 3.1 хувилбарыг ашиглан Сплит декомпозицын
(АТФ синтаза альфа дэд нэгж) зэрэг болно. Эдгээр туслах генүүдийн хромосом дээрх
анализаар дүрслэн харууллаа [30,31].
локусуудын байршлаас үзэхэд локусуудын хоорондох хамгийн бага зай 70 кб учраас

тэдгээрийн аль нь ч гэсэн нэг ижил рекомбинацид хамт удамших боломжгүй байсан
байна. ДНХ ханд бэлтгэн урвалыг Ampli Taq – 12,5 мкл, ариун нэрмэл ус – 9,5мкл,
праймер тус бүр 1мкл, дээж 1мкл нийт 25мкл-ыг багтаамжинд урьтал денатураци 95
хэмд 10 минут, 94 хэмд 30 сек, 50 хэмд 30 сек, 72 хэмд 1 мин, эцсийн уртасгалт 72
хэмд 10 минут нийтдээ 35 цикл, давтамжтайгаар термоциклэрт гүйцэтгэв. Олшруулсан
бүтээгдэхүүнээ 1%-ийн агароз гель ашиглан электрофорезийг 20 минут гүйлгэв.

Олшруулсан ПГУ-ын бүтээгдэхүүнээ Puregene цомог (Centra systems, Inc.,
Minneapolis) ашиглан ДНХ цэвэршүүлэн ялгаж авав. Цэвэршүүлсэн ДНХ дээрээ
доорхи хос праймеруудыг C.jejuni- ийн өвөрмөц нуклеотидын дараалал бүхий
праймеруудийг (хүснэгт7) ашиглан урьтал денатураци 95 хэмд 10минут, 94 хэмд 30

секунд, 50 хэмд 30 секунд, 72 хэмд 1минут, эцсийн уртасгалт 72 хэмд 3 минутад
25циклд олшруулав. ПГУ-ын нөхцөл дор олшруулсан бүтээгдэхүүнээс 6 мкл-ийг
22 23