Page 21 - Isolasi Pemurnian dan Identifikasi Senyawa Golongan Flavanoid

pada dinding bejana hingga hampir mencapai puncak bejana. Bejana ditutup dengan
penutup kaca atau lainnya dan biarkan selama beberapa menit untuk menaiki kertas

saring dan menjenuhi ruang udara bejana. Kegagalan dalam penjenuhan bejana akan

menghasilkan pemisahan yang buruk dan hasil yang tidak reprodusibel.
 Pelat KLT kemudian diletakkan di dalam bejana sedemikian rupa sehingga spot

sampel tidak mengenai permukaan eluen di dalam bejana, kemudian bejana ditutup.
Pelarut akan mendaki pelat berdasarkan gaya kapilaritas, bertemu dengan campuran

sampel dan membawanya naik mendaki pelat (mengelusi sampel). Pelat harus

dikeluarkan dari dalam bejana sebelum pelarut menyentuh bagian atas dari fasa diam
(meneruskan elusi hingga atas akan menghasilkan hasil yang menyesatkan), kemudian

dikeringkan.
Oleh karena senyawa yang berbeda akan menempuh jarak yang berbeda pada fasa

diam, maka kromatografi dapat digunakan sebagai suatu teknik isolasi. Senyawa yang
terpisah masing-masing memiliki luas area yang spesifik pada pelat, dan dapat dikerok,

kemudian dilarutkan dalam pelarut untuk memisahkannya dari fasa diam untuk digunakan

dalam analisis lanjutan. Sebagai contoh ekstrak hijau daun (misal bayam) dalam 7 tahapan
pengembangan, karoten terelusi dengan cepat dan hanya tampak hingga tahap 2. Klorofil A

dan B menempuh separuh jalan, dan lutein adalah senyawa pertama yang berwarna kuning.
Setelah kromatografi selesai, karoten dapat dikerok dari pelat, dilarutkan dalam suatu pelarut

dan dilakukan uji spektrofotometri untuk menentukan panjang gelombang absorpsinya.

3.3.3 Kromatografi cair kinerja tinggi

Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) merupakan modernisasi dari kromatografi
kolom dimana peralatannya dalam bentuk elektronik atau instrumentasi. Sesuai namanya,

prinsip HPLC menggunakan prinsip kromatografi untuk mengukur sampel. Dalam

kromatografi, analisis dilakukan dengan cara memisahkan molekul berdasarkan perbedaan
struktur ataupun komposisinya.

Prinsip kerja HPLC adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya, alatnya
terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang

paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan
tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan

Isolasi Pemurnian dan Identifikasi Senyawa Golongan Flavanoid 21