Page 24 - Адууны томуу өвчний тандан судалгаа, үүсгэгчийн ялган авч тодорхойлсон нь
P. 24
Ё. Мягмарсүх “Адууны томуу өвчний тандан судалгаа, үүсгэгчийг ялган авч тодорхойлсон нь”
Урвуу транскриптаз-полимеразын гинжин урвалд хэрэглэгдэх
температур, хугацааны тохируулга
6-р хүснэгт
кДНХ болгох (УТ) дулаан солилцох үечлэл ПГУ-ын дулаан солилцох үечлэл
Праймер холбогдох шат 42⁰ - 4.5’ Анхдагч денатурацийн шат 94⁰ - 1’
Нийлэгжих шат 95⁰ - 5’ Хоёр дахь денатурацийн шат 94⁰ - 20’’
Хөргөх 4⁰ - ∞ Праймер холбогдох шат 53⁰ - 30’’
Уртсах шат 72⁰ - 2’
Нийлэгжих шат 72⁰ - 5’
Хөргөх 4⁰ - ∞
Харин дээрх урвалаар эерэг гарсан дээжнүүдийг ДМАЭМБ-ийн зөвлөмжийн
дагуу [40] адууны томуугийн А хүрээний Н3N8 хэвшлийг тодорхойлох хэвшил
өвөрмөц (H3N8-2F 5’-GCAAAAGCAGGGTGACAAAAAC-3’ болон H3N8-866R 5’-
GAAACAAGGGTGTTTTTATC-3’) хос праймер тус бүрээс 1 мкл, SuperScript® III
Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA) полимераз энзимийн 10x buffer-ээс
4 мкл, dNTP-ээс 2 мкл, цэвэршүүлсэн уснаас 14.8 мкл, дээжнээс 2 мкл-ыг тус тус
хийж 94°C -д 1 минут халаах, 94°C -д 30 секунд 53°C -д 35 секунд 72°C -д 1
минутаар, 72°C -д 5 минутаар нийлэгжүүлж 35 удаагийн давтамжтайгаар праймер
холбогдох, 4°C -д 10 минут уртасгах зарчмаар GeneAmp PCR System 9700 (Applied
Biosystem, USA) термоциклер ашиглан УХ-ПГУ-ыг явуулсны дараа эцсийн
бүтээгдэхүүнийг 1,5%-ийн агорозын гель, ТАЕ буфер ашиглан гүйлгэж, этидиум
бромидээр будан трансиллюминаторт харж, үр дүнг уншив (7-р хүснэгтийн дагуу).
Хэвшил тодорхойлох полимеразын гинжин урвалд хэрэглэгдэх энзим,
урвалжийн хэмжээ болон температур, хугацааны тохируулга
7-р хүснэгт
ПГУ-ын холимог ПГУ-ын дулаан солилцох үечлэл
10 х буфер (SuperScript®) (4.0 мкл) Анхдагч денатурацийн шат 94⁰ - 1’
dNTP mix (SuperScript®) (2.0 мкл) Хоёр дахь денатурацийн шат 94⁰ - 30’’
Taq (SuperScript®) (0.2 мкл) Праймер холбогдох шат 53⁰ - 35’’
H3N8-2F праймер (1.0 мкл) Уртсах шат 72⁰ - 1’
H3N8-866R праймер (1.0 мкл) Нийлэгжих шат 72⁰ - 5’
ПГУ-н бүтээгдэхүүн (эерэг гарсан) (2.0 мкл) Хөргөх 4⁰ - ∞
Цэвэршүүлсэн ус (14.8 мкл)
Нийт хэмжээ 25.0 мкл
20
