Page 25 - Адууны томуу өвчний тандан судалгаа, үүсгэгчийн ялган авч тодорхойлсон нь
P. 25
Ё. Мягмарсүх “Адууны томуу өвчний тандан судалгаа, үүсгэгчийг ялган авч тодорхойлсон нь”
3.6. Агарозын гель, электрофорез гүйлгэх, нуклеотидын
дараалал тогтоох
Агарозын гель электрофорез гүйлгэх: Агарозын гель, электрофорез нь
макромолекулыг цахилгаан соронзон оронд молекул жингээр нь ялгаж,
тодорхойлдог зарчим дээр үндэслэдэг. ДНХ-ийг молекул жингээр ялгахдаа агарын
гелийг ашигладаг. Агарыг нүхлэн шинжлэгдэхүүнийг тодорхой хэмжээгээр
дусаасны дараа цахилгаан гүйдэлд залгахад шинжлэгдэхүүн дэх уургууд нь
цэнэгийнхээ ялгаанаас хамаарч харилцан адилгүй хурдтай нүүн шилждэг. Гель
дэх ДНХ-ийг бромт этидээр 20 минут будаж ДНХ-ийн нягтралыг
фотолюминесценцийн аргаар хэмжинэ [39].
Агарозын гель 1,5%-ийг бэлтгэхийн тулд 1,5 гр хуурай агароз дээр 100 мл
TBE буфер уусмал нэмж сайтар холиод 100 °С-т буцалгаж агароз бүрэн ууссаны
дараа гелийн хэвэнд цутгаж бүрэн царцах хүртэл хүлээнэ. Үүний дараа үүр бүхэнд
0,2 мкл ачаалах буфертэй хольсон 10 мкл ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг нэмнэ. Эерэг
контрол-10 мкл, сөргийн хяналт - 10 мкл, ДНХ маркер - 5 мкл-г тус тус үүрэнд
хийж гель электрофорезийг 100В-д 20 минут гүйлгэнэ. Ачаалах буферын хөх
будаг гелийн ирмэг рүү дөхөх үед зогсоож 10 мкг/мл агууламж бүхий этидиум
бромидоор 20 минут будаж хэт ягаан туяаны трансиллюминаторт харж шалгана
[29, 39].
Нуклеотидын дараалал тогтоох: Вирусын хэвшлийг хэвшил өвөрмөц
праймер ашиглан баталгаажуулахаас гадна нуклеотидийн дараалал тогтоох
аргаар баталгаажуулав. Үүний тулд HA, NA, M генийн бүтэн хэсгийг олшруулах
праймер ашиглан шууд нуклеотидийн дараалал тогтоох BigDye Terminator v 3.1
cycle sequencing Kit (Applied Bioscience, USA) цомог ашиглан, үйлдвэрлэгчийн
зааврын дагуу нуклеотидийн дарааллыг тогтоож, улмаар BLAST хайлт систем
ашиглан өөр бусад адил төсөөт нуклеотидийн дарааллыг олж, харьцуулалт
хийв. Хайлтын системээс илэрсэн адил төсөөтэй вирус болон өөрсдийн гарган
авсан вирусын нуклеотидийн дарааллаа Neighbor Joining (NJ) bootstrap аргад
үндэслэсэн MEGA 5.1 (http://www.megasofthware.net) программ ашиглан
харьцуулалт хийж удам төрлийн модыг байгуулав [40, 41].
21
