Page 118 - 猪场生产管理手册
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⑤猪伪狂犬病抗体酶联免疫吸附试验材料
参照猪伪狂犬病抗体检测试剂盒说明书操作。
⑥伪狂犬病毒 PCR 试剂盒检测
a.样品制备：病死或扑杀的猪，取大脑海马背侧皮层、中脑、脑桥、扁桃体、淋
巴结等组织；待检活猪，用棉拭子取鼻腔分泌物，置于 50%甘油生理盐水中，或用
注射器取血 5mL，2~8℃保存。要求送检病料新鲜，严禁反复冻融。
组织样品的处理：称取组织 0.1g 于研磨器中磨碎，再加 1mL 生理盐水继续磨至
无块状物，然后将样品转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000r／min 离心 5min，取上清
100µL 于 1.5mL 灭菌离心管中，加入 500µL 裂解液和 10µL 蛋白酶 K，混匀后 37℃
温育 1h。
全血样品的处理：待血凝后取血清放于离心管中，8000r／min 离心 5min，取上
清 100µL 于 1.5mL 灭菌离心管中，加入 500µL 裂解液和 10µL 蛋白酶 K，混匀后 37℃
温育 1h。
阳性对照的处理：混匀后取 100µL 于 1.5mL 灭菌离心管中，加入 500µL 裂解液
和 10µL 蛋白酶 K，混匀后 37℃温育 1h。
阴性时照的处理：混匀后取 100µL 于 1.5mL 灭菌离心管中，加入 500µL 裂解液
和 10µL 蛋白酶 K，混匀后 37℃温育 1h。
b.病毒 DNA 的提取
取出已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入 600µL 抽提液（用抽提液
之前不要晃动，不要吸到上层保护液），用力颠倒 10 次混匀，12000r/min 离心 10min。
取 500µL 上清液置于灭菌离心管中，加入 500µL 异丙醇，混匀，置液氮中 3min
或-70℃冰箱中 30min。取出样品管，室温融化，13000r/min 离心 15min。
弃上清液，沿管壁缓缓加入 1mL 洗涤液，轻轻旋转 1 周后倒掉，将离心管倒扣
于吸水纸上 1min，再将离心管真空抽干 15min 或 37℃烘干。
用 30µL 无菌水溶解沉淀，作为模板备用。
c.PCR
反应体系：分别取 16µL PCR 反应液 A（用前混匀）、2µL PCR 反应液 B（用前
混匀）和 2µL 模板 DNA，混匀。
反应程序：在 PCR 仪上运行以下程序：94℃ 3min；94℃ 30s；55℃ 30s；72℃
30s；35 个循环，72℃延伸 10min。
d.电泳
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